CRISPR/Cas9介導(dǎo)的染色體清除

CRISPR/Cas9?是基于細(xì)菌?II?型?CRISPR/Cas?免疫防御系統(tǒng)開發(fā)的基因編輯技術(shù)，由于其操作簡(jiǎn)單，并能高效介導(dǎo)精確的基因敲除、敲入等而被廣泛用于各物種的基因編輯研究。鑒于上述方法的復(fù)雜和低效性，Zuo?等嘗試將?CRISPR/Cas9?技術(shù)用于染色體的靶向清除。CRISPR/Cas9?系統(tǒng)包括兩個(gè)核心部件，本身無靶向性的?Cas9?核酸內(nèi)切酶以及引導(dǎo)?Cas9?進(jìn)行靶向切割的引導(dǎo)?RNA（single guided RNA，sgRNA），Cas9?和?sgRNA?結(jié)合，以復(fù)合物的形式在特定位置切斷雙鏈?DNA。他們發(fā)現(xiàn)通過多個(gè)位點(diǎn)的?CRISPR/Cas9?靶向切割，細(xì)胞系、胚胎和體內(nèi)組織的性染色體，以及腫瘤細(xì)胞等的常染色體能被選擇性清除。這個(gè)方法可為特定染色體缺失動(dòng)物模型的構(gòu)建，以及相關(guān)人類遺傳病的治療提供新的策略^[49]，也是合成基因組學(xué)中內(nèi)源染色體靶向清除的潛在技術(shù)手段。

當(dāng)前，全基因組合成已經(jīng)在病毒及細(xì)菌上獲得成功，首個(gè)全人工合成的真核生物——Sc2.0?也已經(jīng)接近完成，對(duì)于更高等生物的全基因組合成也已經(jīng)提上日程。然而，由于基因組極其龐大，要實(shí)現(xiàn)這些基因組的合成將依賴于上述各項(xiàng)技術(shù)的突破以及新技術(shù)的出現(xiàn)。

獲得自然界不存在的基因組，DNA?合成是目前唯一的手段；對(duì)于龐大基因組的合成需要更高效率、更高精度的?DNA?合成技術(shù)，同時(shí)需要進(jìn)一步降低合成成本。與化學(xué)法相比，DNA?的酶促合成有著諸多優(yōu)勢(shì)，但是距離商業(yè)化應(yīng)用尚需時(shí)日。在大基因組的設(shè)計(jì)與合成中，如果可以直接使用自然界存在的?DNA?片段，可以節(jié)省?DNA?合成的成本，但同樣需要相應(yīng)的技術(shù)支撐。常規(guī)長度的?DNA?片段可以通過?PCR?或者酶切等方式獲取，但對(duì)于超大片段，這些策略難以勝任。CRISPR/Cas9?技術(shù)的出現(xiàn)使得直接從天然基因組中特異切割獲取大片段?DNA?成為可能。例如，我國清華大學(xué)朱聽和中國科學(xué)院微生物研究所婁春波等就聯(lián)合開發(fā)了基于?CRISPR/Cas9?和?Gibson?組裝的克隆策略，可獲得長達(dá)?150?kb?的DNA?片段。

在合成基因組拼裝方面，酵母由于本身具備很強(qiáng)的?DNA?重組能力，是合成基因組學(xué)的重要分子操作工具，而對(duì)于未來超大基因組的合成，酵母能否勝任需要我們探討驗(yàn)證。此外，合成基因組的分離提取，轉(zhuǎn)移技術(shù)都會(huì)隨著目的基因組的增大而面臨效率減低，甚至不適用等問題，新型技術(shù)亟待開發(fā)。野生型基因組的清除是獲得完整基因組合成生物體必經(jīng)步驟，CRISPR/Cas9?技術(shù)有望勝任超大內(nèi)源基因組的清除，但對(duì)于內(nèi)源基因組不同的位點(diǎn)，其切割效率可能不一致，可能需要優(yōu)化篩選；另外，技術(shù)本身存在的脫靶效應(yīng)可能會(huì)作用于植入的合成基因組，這些問題都需要在基因組設(shè)計(jì)階段予以考慮。

當(dāng)前，我國在合成生物學(xué)領(lǐng)域已經(jīng)取得一定的成就，尤其在?Sc2.0?計(jì)劃上，我國科學(xué)家作出了重大貢獻(xiàn)。作為新興交叉學(xué)科，除了基本技術(shù)體系，合成生物學(xué)的發(fā)展還面臨其他眾多技術(shù)難題，這也是我們產(chǎn)出原創(chuàng)性成果、培養(yǎng)交叉型人才的機(jī)遇。（作者：盧俊南，中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院合成生物學(xué)研究所合成基因組學(xué)研究中心深圳市合成基因組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；羅周卿，中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院合成生物學(xué)研究所合成基因組學(xué)研究中心深圳市合成基因組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；姜雙英，中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院合成生物學(xué)研究所合成基因組學(xué)研究中心深圳市合成基因組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；沈玥，華大基因（深圳）；吳毅，天津大學(xué)化學(xué)工程與技術(shù)學(xué)院教育部系統(tǒng)生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；楊煥明，華大基因（深圳）；元英進(jìn)，天津大學(xué)化學(xué)工程與技術(shù)學(xué)院教育部系統(tǒng)生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；戴俊彪，中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院合成生物學(xué)研究所合成基因組學(xué)研究中心深圳市合成基因組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室?！吨袊茖W(xué)院院刊》供稿）

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