3.5 高效液相色譜測(cè)定
3.5.1 HPLC 參考條件
a) 色譜柱：C8柱，250 mm×4.6 mm（i.d.），5 μm，或相當(dāng)者；
C18柱，250 mm×4.6 mm（i.d.），5 μm，或相當(dāng)者。
b) 流動(dòng)相：C8柱，離子對(duì)試劑緩沖液（3.2.10）-乙腈（85+15，體積比），混勻。
C18柱，離子對(duì)試劑緩沖液（3.2.10）-乙腈（90+10，體積比），混勻。
c) 流速：1.0 mL/min。
d) 柱溫：40℃。
GB/T 22388—2008
e) 波長(zhǎng)：240 nm。
f) 進(jìn)樣量：20 μL。
3.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
用流動(dòng)相將三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液逐級(jí)稀釋得到的濃度為0.8、2、20、40、80 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)工作液，濃度由低到高進(jìn)樣檢測(cè)，以峰面積-濃度作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程?；|(zhì)匹配加標(biāo)三聚氰胺的樣品HPLC 色譜圖參見附錄A 中的圖A.1。
3.5.3 定量測(cè)定
待測(cè)樣液中三聚氰胺的響應(yīng)值應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍內(nèi)，超過線性范圍則應(yīng)稀釋后再進(jìn)樣分析。
3.5.4 結(jié)果計(jì)算
試樣中三聚氰胺的含量由色譜數(shù)據(jù)處理軟件或按式（1）計(jì)算獲得：
A × c × V×1000
X= × f ……………………（1）
As × m×1000
式中：
X —— 試樣中三聚氰胺的含量，單位為毫克每千克（mg/kg）；
A —— 樣液中三聚氰胺的峰面積；
c —— 標(biāo)準(zhǔn)溶液中三聚氰胺的濃度，單位為微克每毫升（μg/mL）；
V —— 樣液最終定容體積，單位為毫升（mL）；
As —— 標(biāo)準(zhǔn)溶液中三聚氰胺的峰面積；
m —— 試樣的質(zhì)量，單位為克（g）；
f —— 稀釋倍數(shù)。
3.6 空白實(shí)驗(yàn)
除不稱取樣品外，均按上述測(cè)定條件和步驟進(jìn)行。
3.7 方法定量限
本方法的定量限為2 mg/kg。
3.8 回收率
在添加濃度2 mg/kg～10 mg/kg濃度范圍內(nèi)，回收率在80%～110%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%。
3.9 允許差
在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過算術(shù)平均值的10%。
4 第二法液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法（LC-MS/MS）
4.1 原理
試樣用三氯乙酸溶液提取，經(jīng)陽(yáng)離子交換固相萃取柱凈化后，用液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法測(cè)定和確證，外標(biāo)法定量。
GB/T 22388—2008
4.2 試劑與材料
除非另有說明，所有試劑均為分析純，水為GB/T 6682規(guī)定的一級(jí)水。
4.2.1 乙酸。
4.2.2 乙酸銨。
4.2.3 乙酸銨溶液（10 mmol/L）：準(zhǔn)確稱取0.772 g 乙酸銨于1 L 容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，
混勻后備用。
4.2.4 其他同3.2。
4.3 儀器和設(shè)備
4.3.1 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜（LC-MS/MS）儀：配有電噴霧離子源（ESI）。
4.3.2 其他同3.3。
4.4 樣品處理
4.4.1 提取
4.4.1.1 液態(tài)奶、奶粉、酸奶、冰淇淋和奶糖等
稱取1 g（精確至0.01 g）試樣于50 mL具塞塑料離心管中，加入8 mL三氯乙酸溶液（3.2.8）和2 mL乙腈，超聲提取10 min，再振蕩提取10 min后，以不低于4000 r/min離心10 min。上清液經(jīng)三氯乙酸溶液潤(rùn)濕的濾紙過濾后，做待凈化液。
4.4.1.2 奶酪、奶油和巧克力等
稱取1 g（精確至0.01 g）試樣于研缽中，加入適量海砂（試樣質(zhì)量的4倍～6倍）研磨成干粉狀，轉(zhuǎn)移至50 mL具塞塑料離心管中，加入8 mL三氯乙酸溶液（3.2.8）分?jǐn)?shù)次清洗研缽，清洗液轉(zhuǎn)入離心管中，再加入2mL乙腈，余下操作同4.4.1.1中“超聲提取10 min，……做待凈化液”。
注：若樣品中脂肪含量較高，可以用三氯乙酸溶液飽和的正己烷液-液分配除脂后再用SPE柱凈化。
4.4.2 凈化
將4.4.1中的待凈化液轉(zhuǎn)移至固相萃取柱（3.2.13）中。依次用3 mL水和3 mL甲醇洗滌，抽至近干后，用6 mL氨化甲醇溶液（3.2.9）洗脫。整個(gè)固相萃取過程流速不超過1 mL/min。洗脫液于50℃下用氮?dú)獯蹈?，殘留物（相?dāng)于1 g試樣）用1 mL流動(dòng)相定容，渦旋混合1 min，過微孔濾膜（3.2.16）后，供LC-MS/MS測(cè)定。
4.5 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜測(cè)定
4.5.1 LC 參考條件
a) 色譜柱：強(qiáng)陽(yáng)離子交換與反相C18混合填料，混合比例（1：4），150 mm×2.0 mm（i.d.），5 μm，或相當(dāng)者。
b) 流動(dòng)相：等體積的乙酸銨溶液（4.2.3）和乙腈充分混合，用乙酸調(diào)節(jié)至pH=3.0后備用。
c) 進(jìn)樣量：10 μL。
d) 柱溫：40℃。
e) 流速：0.2 mL/min。
4.5.2 MS/MS 參考條件
a) 電離方式：電噴霧電離，正離子。
b) 離子噴霧電壓：4 kV。
c) 霧化氣：氮?dú)猓?0 psi。
d) 干燥氣：氮?dú)?，流?0 L/min，溫度350℃。
e) 碰撞氣：氮?dú)狻?/p>
f) 分辨率：Q1（單位）Q3（單位）。
g) 掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM），母離子m/z 127，定量子離子m/z 85，定性子離子m/z 68。
h) 停留時(shí)間：0.3 s。
i) 裂解電壓：100 V。
j) 碰撞能量：m/z 127>85 為20 V，m/z 127>68 為35 V。
4.5.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
取空白樣品按照4.4 處理。用所得的樣品溶液將三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（3.2.12）逐級(jí)稀釋得到的濃度為0.01、0.05、0.1、0.2、0.5 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)工作液，濃度由低到高進(jìn)樣檢測(cè)，以定量子離子峰面積-濃度作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程?；|(zhì)匹配加標(biāo)三聚氰胺的樣品LC-MS/MS 多反應(yīng)監(jiān)測(cè)質(zhì)量色譜圖參見附錄A 中的圖A.2。
4.5.4 定量測(cè)定
待測(cè)樣液中三聚氰胺的響應(yīng)值應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍內(nèi)，超過線性范圍則應(yīng)稀釋后再進(jìn)樣分析。
4.5.5 定性判定
按照上述條件測(cè)定試樣和標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，如果試樣中的質(zhì)量色譜峰保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)工作溶液一
致（變化范圍在±2.5%之內(nèi)）；樣品中目標(biāo)化合物的兩個(gè)子離子的相對(duì)豐度與濃度相當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)溶液的相對(duì)豐度一致，相對(duì)豐度偏差不超過表1的規(guī)定，則可判斷樣品中存在三聚氰胺。
表1 定性離子相對(duì)豐度的最大允許偏差
相對(duì)離子豐度>50% >20%至50% >10%至20% ≤10%
允許的相對(duì)偏差±20% ±25% ±30% ±50%
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