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下載安裝Flash播放器人粒細胞無形體病實驗室檢測方案（試行）
為保證及時、科學地采集、運送人粒細胞無形體病病例（包括疑似病例）及疫源地調查的各種類型標本，規(guī)范人粒細胞無形體病的實驗室檢測程序，提高檢測質量，為明確診斷或開展相關的科學研究提供實驗室依據，特制定本方案。
一、樣本采集對象
（一） 人粒細胞無形體病病例（包括疑似病例，以下同）。
（二） 病例密切接觸者或其他健康人群。
（三） 疫源地可疑宿主動物（野生動物及狗、羊、牛等家畜）、媒介蜱。
二、標本種類及采集方法
（一） 抗凝血。
常用EDTA抗凝管或枸櫞酸鹽抗凝管采集血液5ml，用于病原分離。應盡可能在病人使用抗生素前進行血液的采集。
（二）非抗凝血。
用無菌真空管，采集病例、健康人群及宿主動物非抗凝血5ml，用于血清抗體及PCR檢測。采集后，應及時分離血清，將血清、血球分別保存。急性期抗體及PCR檢測用血液采集盡可能在發(fā)病后1周內，恢復期抗體檢測標本采集至少間隔2-3周。如第2份血清在1個月之內抗體升高不明顯的，應建議間隔2-4周后采集第3份血液標本。
（三）包涵體檢測血涂片的制備。
采集血液標本后，制作厚血片，進行紅細胞裂解處理等。
（四）媒介蜱標本的采集。
采集動物體表媒介蜱，用鑷子夾取，放入鋪墊有潮濕濾紙或紗布的青霉素小瓶或試管中，用紗布包緊瓶口以防止蜱爬出。實驗室接到蜱標本后，首先應進行種屬鑒定，然后按類別分組（1-5只蜱/組），采用75%酒精浸泡30min后，用無菌蒸餾水反復沖洗3次。最后進行分組研磨，研磨液用于提取DNA，進行PCR擴增。
（五）有條件時，可采集活檢或尸檢標本，冰凍、福爾馬林固定或石蠟包埋后進行實驗室檢測。具體方法參照病理實驗室相關要求和衛(wèi)生部《傳染病人或疑似傳染病人尸體解剖查驗規(guī)定》的相關要求。
三、標本采集和保存注意事項
標本采集應符合無菌操作要求。抗凝血如不能立即床邊接種，應置于4℃環(huán)境保存，避免冰凍（不超過2周）。非抗凝血應及時進行無菌分離血清，血清用于抗體檢測，血球部分研磨后提取DNA用于PCR檢測。如不能及時檢測，可暫置于－20℃環(huán)境保存。所有標本應置入大小適合、帶螺旋蓋、內有墊圈的凍存管內，擰緊管口。
標本采集后，應認真填寫采樣登記表。
四、實驗室檢測
（一）包涵體的檢測。
1. 血片及白細胞涂片制備
采集的抗凝血標本盡快用血球層推血片，待干燥后冷丙酮固定10min；或提取抗凝血中的白細胞并進行涂片，待干燥后冷丙酮固定10min。
2. 染色
通常采用瑞氏（Wright）染色法、姬氏(Giemsa)染色法及瑞－姬混合染色法。有條件的實驗室，可使用美國CDC推薦的染色方法。
3. 染液配置方法
（1）瑞－姬染液：取瑞氏染料和姬氏染料各0.5 g，以甲醇研溶，加甲醇500ml保存，每天搖勻１次，１周后可使用。
（2）改良Mc Donald法瑞－姬染色劑：75 ml甘油（分析純）中加入磷酸鹽緩沖液（Na2HPO4 1g和KH2PO4 2g），以4 ml蒸餾水溶解，37 ℃水浴24 h溶解混勻，用濾紙過濾，保存于密封的棕色瓶中備用。上述甘油緩沖液1.5 ml加瑞－姬染色劑50 ml，混勻后備用。
4. 染色步驟
血推片或白細胞涂片分別以兩種染色劑染色2 min，再加蒸餾水作用5 min，用自來水沖洗。
5. 結果觀察
中性粒細胞中可見桑葚狀包涵體（見圖1），并注意保存相關標本，以便進行復核。
（二）血清學檢測。
常用血清學方法為間接免疫熒光（IFA）法。采集急性期（發(fā)熱初期，一般發(fā)病1周內）與恢復期（至少間隔2-3周）雙份血清。如恢復期血清抗體檢測陰性，應建議醫(yī)生采集第3份血液樣本（間隔2-4周）。
1. 試劑
使用國際推薦的、經過ISO質量認證的產品。
2. 方法及操作按說明書進行。
3. 結果解釋
IFA檢測結果解釋按說明書進行。
如果同時檢測雙份血清，IgG抗體4倍升高，則結果強烈支持嗜吞噬細胞無形體感染。如果急性期抗體升高，而恢復期沒有升高或輕微升高，則應采集第3份血液樣本（間隔2-4周）進行進一步檢測。